Edición 65 - Septiembre 2017 / Revisión de Temas

Revisión de Temas – Ed. 65

TRADUCCION AL ESPAÑOL TOMADA DEL “HORMONE RES. PAEDIATR.” AUTORIZADA POR KARGER AG, 2017 S. Basel.

https://www.karger.com/Article/Abstract/464143

Nuevas Ideas en la Práctica Clínica

 
HORMONE
RESEARCH IN
PÆDIATRICS
DOI: 10.1159/000464143
Mayo 2017

Expandiendo los Diagnósticos Genético y Funcional de las Haploinsuficiencias del IGF1R

Paula Ocaranzaa, Marjorie C. Golekohb, Shayne F. Andrewc, Michael H. Guod, Paul Kaplowitze, Howard Saalf, Ron G. Rosenfeldg, Andrew Dauberc Fernando Cassorlaa, Philippe F. Backeljauwc, Vivian Hwac.

P. Ocaranza, M.C. Golekoh, S.F. Andrew y M.H. Guo son primeros co-autores
aInstitute of Maternal and Child Research, School of Medicine, University of Chile, Santiago, Chile;  bPediatric Endocrinology, Children’s Hospital of Michigan, Detroit, MI, USA; cCincinnati Center for Growth Disorders, Division of Endocrinology, Cincinnati Children’s Hospital Medical Center, Cincinnati, OH, USA; dDivision of Endocrinology, Boston Children’s Hospital and Department of Genetics, Harvard Medical School, Boston, MA, USA; eDivision of Pediatric Endocrinology and Diabetes, Children’s National Health System, Washington, DC, USA; fDivision of Human Genetics, Cincinnati Children’s Hospital Medical Center, Cincinnati, OH, USA; gDepartment of Pediatrics, Oregon Health & Science University, Portland, OR, USA.


Hechos establecidos

– Las variaciones en el número de copias (VNC) que involucran al receptor del factor de crecimiento insulino-simil1 (IGFIR) tienen como resultado grados variables de restricción del crecimiento pre y postnatal.


Nuevas Ideas.

– El descubrimiento de VNCs basado en secuenciación total del exoma (west exom sequencing, WES) expande el espectro de la información que puede ser derivada del análisis de la WES: a partir de 27 VNC se descubrieron 4492 Mb de VNC en el gen del IGF1R.

– La haploinsuficiencia alélica del IGF1R fue traducida en una disminución de alrededor del 50% de la disponibilidad de la proteína en la superficie celular, luego del análisis de clasificación celular por fluorescencia activada (fluorescence-activated cell sorting, FACS). Este demostró, mediante evidencia de tipo funcional, la importancia crítica de la expresión bialélica de la proteína.

– El análisis FACS en células primarias vivas es un método prometedor para evaluar con eficiencia, y poder pesquisar la haploinsuficiencia del IGF1R.


Resumen.

CONTEXTO: Los efectos promotores del crecimiento del IGF-1 son mediados a través del receptor de IGF-1 (IGF1R), un receptor tirosina quinasa de superficie celular, ampliamente expresado.  Las VNC del IGF1R pueden producir restricción del crecimiento, sobre-crecimiento, pre- y/o postnatal. MÉTODOS: Se llevaron a cabo WES, microarray cromosómico, y análisis dirigido del gen IGF1R, en 3 niños no-relacionados entre sí, que compartían características de haber sido pequeños para edad gestacional, tener talla baja, y valores elevados de IGF-1 en suero, pero que también mostraban heterogeneidad clínica. Se realizó FACS del IGF1R en células vivas derivadas de los pacientes. RESULTADOS: Se identificaron en los pacientes dos nuevas VNC en IGF1R y una variante heterocigota sin-sentido. Se identificó una VNC (de 4492 Mb) exitosamente por WES, utilizando análisis por el modelo XHMM, (eXome-Hidden Markov Model). El análisis FACS sobre el IGF1R en células vivas primarias derivadas de los pacientes demostró una reducción del 50% en la disponibilidad del IGF1R asociada al estado de haploinsuficiencia. CONCLUSIÓN: Además de los métodos convencionales, las VNC del IGF1R pueden ser identificadas a partir de los datos de la WES. El análisis FACS de células primarias vivas es un método promisorio para evaluar eficientemente y pesquisar la haploinsuficiencia del IGF1R. Se requieren investigaciones adicionales para delinear, de qué forma, la disponibilidad del IGF1R conduce al vasto espectro de fenotipos clínicos y de respuestas terapéuticas a la rhGH.

 

Introducción        

El crecimiento humano normal, tanto intrauterino como postnatal, requiere de un eje IGF-1 – IGF1R intacto. La haploinsuficiencia de IGF1R secundaria a defectos moleculares se asocia a crecimiento disminuido e indica que uno de los dos alelos del gen es insuficiente para lograr un crecimiento y desarrollo normales. Una pérdida completa de IGF1R no ha sido reportada en humanos, y podría ser letal, como se ha demostrado en estudios en roedores en los cuales la ablación dirigida del gen Igf1r resultó en muerte perinatal [1, 2]. En efecto, en los casos de las mutaciones dirigidas en IGF1R más hipomórficas descriptas hasta la fecha (2 mutaciones misssence homocigotas [3, 4] y 2 mutaciones heterocigotas compuestas en IGF1R [5, 6]), las expresiones y funciones residuales aseguraron la sobrevida, aunque las presentaciones clínicas fueron más severas que en los pacientes haploinsuficientes en IGF1R [7, 8]. Las opciones corrientes de tratamiento con rhGH o rhIGF-1, aprobadas para múltiples indicaciones, incluyendo talla baja idiopática, y niños nacidos pequeños para edad gestacional (small for gestational age, SGA), permanecen en debate, ya que los pacientes con deficiencia de IGF1R exhiben resistencia al IGF-1, con concentraciones de IGF-1 en suero por encima de los rangos normales.

A partir de su síntesis como un polipéptido precursor único, el IGF1R es proteolizado a dos cadenas, α y β y forma un tetrámero (α2β2) con las subunidades extracelulares α2 involucradas en la unión al ligando y las subunidades intracelulares β2 portando las funciones intrínsecas de tirosina kinasa necesarias para la transducción de la señal [9]. La asociación del ligando lleva a la autofosforilación y activación de múltiples vías de señalización corriente abajo, incluyendo la fosfaditilinositol 3-kinasa/AKT, y vías MAKP/ERK importantes para la sobrevida y crecimiento celular [10]. En un estado de haploinsuficiencia de IGF1R se disminuye su señalización parte del IGF-1 [11-13], aunque la unión a IGF-1 podría permanecer normal [14, 15], remarcando aún más la necesidad de una expresión bi-alélica del gen IGF1R para lograr una actividad biológica completa.

En este estudio, se reporta 3 casos nuevos de haploinsuficiencia de IGF1R y se remarca (a) la aplicación por primera vez los datos de la WES para evaluar las VNC en el análisis genético de la talla baja; (b) la utilidad del aislamiento celular por fluorescencia activada (fluorescence-activated cell sorting, FACS) como un método prometedor para evaluar con eficiencia la disponibilidad del IGF1R de la superficie celular, usando células primarias vivas derivadas de pacientes; y (c) la efectividad de la terapia con rhGH para tratar a algunos pacientes.  Este estudio expande el diagnóstico genético y funcional del estado de haploinsuficiencia de IGF1R, enfatiza la importancia de incluir el análisis de VNC en la evaluación inicial de los niños que se presenten con características clínicas y bioquímicas sugestivas de insuficiencia de IGF1R, y plantea preguntas sobre el rol de la disponibilidad de IGF1R en los diversos fenotipos clínicos y en las variables respuestas terapéuticas a la rhGH.

Materiales y Métodos
Casos Clínicos
Paciente 1

El paciente 1 (P1) una niña chilena de 8 años de edad con estatura baja, que había nacido tras una gestación de 35 semanas con un peso de nacimiento de 2,1 kg y una longitud corporal de 42 cm (SDS -2,61), de padres no-consanguíneos. Tuvo crecimiento compensador (hasta el 25º percentilo de longitud corporal) hasta la edad de 5 años, cuando comenzó a desviarse de este canal. A la edad de 8,3 años, su talla era 115, cm (SDS -2,06), su peso de 22,1 Kg (SDS -0,92), su índice de masa corporal era 16,3 (SDS +0,25), y su circunferencia craneana de 51 cm (SDS -1,0). La paciente presentaba segmentos corporales proporcionados y no mostraba caracteres dismórficos.

Sus evaluaciones endocrinas a la edad de 8 años revelaron valores elevados de IGF-1 sérica (488 ng/ml, rango de referencia (RR), 120-385) y IGFBP-3 sérica (6,2 mg/L, RR, 2.2-6.5) para su edad cronológica. Su valor basal de GH en suero fue de 1,1 ng/mL, el cual aumentó a 11,2 ng/mL luego de la estimulación con clonidina. Se hizo diagnóstico de insensibilidad al IGF-1.

Durante el período de terapia con rhGH, comenzando con una dosis relativamente baja de 0,117 mg/Kg/semana se consiguió un aumento significativo en su velocidad de crecimiento. Bajo el tratamiento con rhGH su estatura cambió desde un valor por debajo del percentilo 3 a aproximadamente el percentilo 10 a los 12 años de edad, (Fig 1a). Como era de esperar, la concentración de IGF-1 en suero bajo la terapia con rhGH fue alta (811-1145 ng/m,). Su desarrollo puberal avanzó normalmente, y tuvo su menarca a los 12,5 años de edad.

Su historia familiar reveló que su padre era moderadamente bajo con una estatura de 163 cm (SDS -0,98), mientras que la estatura de su madre es normal (157 cm, SDS -0,98), lo mismo que su hermano de 18 años (estatura 168 cm, SDS -1.2). Un resumen de los estudios endocrinos de P1 se muestra en la tabla 1.

Paciente 2

El paciente 2 (P2) es un varón Caucásico de 8 años de edad con neurofibromatosis tipo 1 (NF-1) que presentó talla baja severa. Había nacido bajo para edad gestacional en la semana 36 con un peso de nacimiento de1,930 kg (SDS -2,25), un longitud corporal de nacimiento de 43,2 cm (SDS -2,3) y circunferencia craneana de 32,5 cm (SDS -1,5) Su gráfico de crecimiento se muestra en la fig 1b. Requirió terapia por retardo moderado motor y del lenguaje en sus primeros años de vida. Su RMN del cerebro mostró una lesión estable   (probablemente un glioma) en el pedúnculo cerebelar inferior izquierdo, con tractos pituitarios y de nervios ópticos normales.

La evaluación endocrina inicial (Tabla 1) mostró una ganancia de peso lenta (SDS -2,5), falla del crecimiento (SDS -3,4) y microcefalia moderada (circunferencia craneana SDS -2,0). El examen físico mostró manchas café-con-leche, un labio superior delgado, clinodactilia del quinto dedo y neurofibromas subcutáneos. Su desarrollo fue acorde a la edad; solamente se observaron síntomas de déficit de atención e hiperactividad.

Figura 1

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Su evaluación endocrina a la edad de 8 años reveló un IGF-1 sérico de 161 ng/ml, y una IGFBP de 4,03 mg/L, ambos normales para edad cronológica.  Su proteína ligadora de GH fue 916 pmo/L; subunidad ácido lábil 8,8 mg/L y la tiroxina fue 2,1 ng/dL, todas dentro del rango normal. La GH sérica se elevó a 15,5 ng/ml luego de la estimulación con arginina/clonidina.

La historia familiar reveló que su abuela materna es moderadamente baja con una talla de 153 cm (SDS -1,8), mientras que sus abuelos paternos son de estatura normal.  Su madre, quien también tiene NF-1 es de talla normal, 160 cm (SDS -0,5), y la estatura de su padre es 178 cm (SDS 0,2). Los datos clínicos de P2 se muestran en la Tabla 1.

Paciente 3

El paciente 3 (P3) es un niña china de 6 años de edad con retardo de crecimiento postnatal severo Nació pequeña para edad gestacional con un peso 1,65 kg (SDS -3,0); su longitud corporal al nacimiento no fue registrada. En el período neonatal fue sometida a cirugía para corregir un defecto septal ventricular y una coartación de la aorta. No habló hasta la edad de 3 años y se diagnosticó que estaba afectada de una alteración auditiva central.

La evaluación endócrina inicial mostró una talla de -5,2 SDS y el peso -5 SDS. El examen físico mostró hipoplasia facial moderada, dentición amontonada, e hipertelorismo ocular. Su IGF-1 sérico fue 296 ng/ml (RR, 52-297) y la IGFBP-3 fue normal. El test de estimulación de GH con clonidina se elevó a 35 ng/ml.

Durante este período recibió terapia con rhGH a una dosis de 0,30 mg/Kg/semana (Fig 1c). Entre las edades de 6,3 y 9,5 años su estatura mejor´a -4,1 SDS con valores persistentemente elevados de IGF-1 y IGFBP-3. La rhGH se discontinuó a los 10 años luego de que no respondió a una dosis más alta de rhGH de 0,42 mg/kg/semana, a pesar de una elevación de la IGF-1 sérica de 709 ng/ml (RR, 65-457) y una IGFBP-3 de 6,5 mg/L (RR, 2,9-5,2). A la edad de 12,13,8 años,, desarrolló mamas Tanner 2, y vello pubiano Tanner 3, menstraciones irregulares, una edad ósea de 13 años y una mejoría en velocidad de crecimiento de 7.1 cm/año sin rhGH y una marcada elevación de la concentración de  IGF-1 sérica de 1183 ng/ml. A la edad de 14,2 años su talla fue 136,4 cm (SDS -3,7). Los datos clínicos de P3 se resumen en la Tabla 1.

Su historia familiar reveló que la estatura de su padre es normal, 170 cm (SDS -0,2), e igualmente la de su madre (163 cm, SDS -0,2). Tiene una hermana, también reportada con crecimiento normal.

Muestras de los Pacientes y de Miembros de la Familia 

Se obtuvieron muestras de sangre de los pacientes y de miembros inmediatos de sus familias para estudios genéticos, con consentimiento informado siguiendo las normas de los comités de ética institucionales respectivos. Los ensayos en suero de P1 se realizaron con técnicas estándar en el Laboratorio del IDIME. Los niveles séricos de IGFBP-3 se determinaron con un ensayo inmunoradiométrico de Diagnostic System Laboratories (Webster, TX, USA). Los ensayos séricos en P2 y P3 se midieron como se describió previamente [ver cita 11].

Cultivos de Células Fibroblásticas Dérmicas Primarias

Se establecieron cultivos primarios de fibroblastos a partir de biopsias de piel tomadas del antebrazo de los pacientes índice (P2, P3) y de un sujeto control con crecimiento pre y post natal normal. Las muestras se recolectaron en concordancia con el protocolo de estudio aprobado por los comités de ética del Hospital Clínico San Borja-Arriarán, Cincinnati Children´s Medical Center, y Oregon Health & Science University. Los cultivos de fibroblastos se mantuvieron como se describió previamente [11].

ADN y ADNc Genómicos

La extracción de ADN genómico de sangre total, o de cultivos primarios de fibroblastos, el ARN total de cultivos de fibroblastos primarios, la síntesis de ADNc, y la secuenciación por Sanger del gen IGF1R han sido descriptas previamente [11]. Los primers para la amplificación del exón 13 son los siguientes: forward, 5´GCCAAGGGTGTGTGGTG-AAAGAGTAA-3´; reverse, 5´-ACCACATGGTGACAATTGAAC TCCTTCATC-3´.

 

Análisis por Hibridización in situ-con Fluorescencia

Se usaron, la sonda RP11-602 de hibridización in situ c/fluorescencia (FISH) y técnicas citogenéticas estándar para confirmar la deleción observada en P2.

Microarray (micromatriz) Microsomal    

Se realizó análisis de Microarray de polimorfismo de nucleótido único (SNP) en muestras de ADN genómico de P2. Se realizó ensayo de Illumina Infinium en muestras de ADN usando la plataforma Cyto-SNP-850K BeadChip. Se analizaron la frecuencia de Alelo B y la relación Log2R con el software para análisis del Illumina GenomeStudio, y los cambios en número de copias se evaluaron usando el software cnvPartition en el Laboratorio de Diagnóstico de Genética Humana del Cincinnati Children´s Hospital Medical Center.

Secuenciación Total del Exoma (WES: whole exome sequencing)

La WES se realizó en ADN extraído de sangre total de P3 y de sus padres. Luego de la construcción de la “library”, se realizó hibridización y captura usando el Rapid Capture Exome Kit de Illumina siguiendo el protocolo sugerido por el fabricante. La secuenciación, alineamiento secuencial corriente abajo, detección y anotación de variantes, se llevaron a cabo como se describió anteriormente [16]. Los exomas se secuenciaron con un objetivo de cobertura medio >80X. Luego se filtraron las variantes raras (frecuencia alélica mínima <1%) no-sinónimas que segregaban con el fenotipo [16]. Las VNC se detectaron usando el algoritmo eXome Hidden Markov Model [17] usando parámetros “default” y ajuste para los primeros 5 componentes principales. Las VNC se agruparon y genotipificaron junto con 189 muestras adicionales secuenciadas en la misma plataforma, incluyendo muestras de los padres de P3.

Análisis de Citometria de Flujo por FACS

Se realizó análisis de citometria de flujo mediante FACS del IGF1R de la superficie celular de fibroblastos primarios vivos (para detalles ver suplemento on line). Brevemente, luego de ser tratados con IGF-1 (100 ng/ml, 24 h.), los fibroblastos adheridos fueron levantados con tripsina 0,05%/EDTA 5 mM., (la actividad de la tripsina fue neutralizada luego con suero fetal bovino) y se procesaron las células para FACS, y para células sanguíneas mononucleares periféricas (PBMC) por triplicado. Las PBMCs se prepararon para FACS de IGF1R superficial [18]. Luego del tratamiento 1 hora con o sin IGF-1 50 ng/ml se incubaron con anticuerpo anti-IGF1R-α humano conjugado con eritrina durante 30 min (4ºC) en la oscuridad, y teñidas con ioduro de propidium (PI) al 0,25%. Se contaron en el citómetro 100000 PBMCs vivos o 20000 fibroblastos vivos (células PI negativas) vía el citómetro de flujo FACSCalibur y se determinó la fluorescencia emitida por las células marcadas con IGF1R-PE.

Análisis por Western Immunoblot     

Los fibroblastos fueron privados de suero una noche y tratados con IGF-1 (15 o 20 min); se recogieron los lisados celulares y se procedió con el análisis de Western Immunoblot [19]. Se utilizaron IgG policlonal de conejo contra fosfo-AKT (dilución 1:1000) y IgG monoclonal de conejo contra Akt (dilución 1:2000), y se utilizó como segundo anticuerpo anti IgG de conejo.

Resultados

Identificación de nuevas variantes heterocigotas de IGF1R

Los perfiles clínicos y bioquímicos de los 3 pacientes fueron consistentes con resistencia a los efectos promotores del crecimiento del IGF-1. Se consideró la posibilidad de un defecto en la expresión del IGF1R. La secuenciación dirigida del gen IGF1R en el ADN genómico (sangre total o fibroblastos en cultivo) de P1 reveló la variante heterocigótica c.2629C>T (rs150221450; frecuencia alélica menor 8.237e-06, Aggregation Consortium Browser) en el exón 13 (Fig. 2a), una variante transicional, confirmada por secuenciación de Sanger, del ADNc IGF1R. El análisis del ADN genómico de otros miembros de la familia reveló que el padre era también heterocigota para c.2929C>T. La c.2929C>T cambia el codón Arg877 (CGA) en un codón stop (TGA), pR877, generando una proteína IGF1R truncada la cual, si se expresara, sería incapaz de anclarse en la membrana celular.

 Tabla 1. Resumen de los datos bioquímicos de los pacientes afectados  

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En contraste con P1, en el caso de P2 y P3 se encontró una VNC del IGF1R. En el caso de P2 el análisis por microarray de SNPs identificó una deleción intersticial heterocigota única de aproximadamente 0,282 Mbs en el cromosoma 15 [46 XY del(15)q26.3(99,438,083-99,720,341)]. Esta región incluye los exones 4-21 del gen IGF1R (Fig. 2b), cuya deleción resulta en una pérdida de aproximadamente 75% de las secuencias codificantes del IGF1R, además de otros 3 genes que tienen efectos fenotípicos desconocidos (PGPEP1L, SYNM, y TTC23). El estudio parental del cromosoma 15q26.3 confirmó una deleción heredada de un alelo materno (Fig. 2b).
La VNC de IGF1R en P3 se identificó luego de revaluar los datos de la WES para VNC, un procedimiento analítico no realizado en forma rutinaria con la WES. El análisis WES inicial (P3 y sus padres) utilizando filtrado astringente de variantes raras no reveló una causa genética obvia del fenotipo. El análisis fue subsiguientemente expandido al análisis de variantes, aplicando el algoritmo XHMM [17]. Se detectaron 27 variantes (16 deleciones y 11 duplicaciones) en la muestra del paciente, incluyendo una gran deleción heterocigota de 4492 Mb en el cromosoma 15 [46 XX del(15)(q26.2:qter)(97,970,832,102,463,314)] (Fig. 2c).  La VNC no se encontró en ninguno de los progenitores, ni en otros 189 exomas que fueron analizados simultáneamente, sugiriendo que la deleción de 4492 MB ocurrió de novo en P3. Todas las otras VNC fueron o heredadas de los padres o estuvieron presentes en otros familiares.
En contraste con P1, en el caso de P2 y P3 se encontró una VNC del IGF1R. En el caso de P2 el análisis por microarray de SNPs identificó una deleción intersticial heterocigota única de aproximadamente 0,282 Mbs en el cromosoma 15 [46 XY del(15)q26.3(99,438,083-99,720,341)]. Esta región incluye los exones 4-21 del gen IGF1R (Fig. 2b), cuya deleción resulta en una pérdida de aproximadamente 75% de las secuencias codificantes del IGF1R, además de otros 3 genes que tienen efectos fenotípicos desconocidos (PGPEP1L, SYNM, y TTC23). El estudio parental del cromosoma 15q26.3 confirmó una deleción heredada de un alelo materno (Fig. 2b).

Las 4492 Mb VNC se incluyeron parcial o totalmente en un total de 28 genes, incluyendo el gen IGF1R (MIM 270450). Cinco de los otros genes dentro de la deleción están asociados con fenotipos Mendelianos que son autosómicos recesivos (MIM 613195,615023,614340, 615113, 605282), y no se encontraron dentro de sus secuencias, variantes adicionales raras que alteren proteínas. Mientras que es posible de que cualquier gen individual, o la combinación de estos 5 genes podrían haber contribuido al complejo fenotipo observado, la búsqueda, en las bases de datos de cada uno de los genes, de funciones y asociaciones con enfermedades (OMIM, PubMed, y UniProt) apoya la conclusión de que la deleción de IGF1R es el contribuyente primario. Es de hacer notar que no se identificó ninguna otra proteína rara capaz de alterar la secuencia de IGF1R. P3 recibió tratamiento con rhGH, pero solo demostró una modesta respuesta de crecimiento a la terapia con GH (Fig. 1c), a pesar de un marcado aumento en las concentraciones de IGF-1 e IGFBP-3 en suero. Lamentablemente, no hubo muestras para un análisis adicional de la expresión y función de la proteína IGF1R.

Figura 2
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Fig.2. Defectos moleculares identificados en los pacientes. Los pacientes se identifican con flechas. Se indica la talla en SDS. Los miembros de la familia no analizados genéticamente se indican con un signo de interrogación.  a Electroferograma de la variante heterocigota IGF1R c.2629C>T en P1 comparando con secuencias normales, y segregación de la variante en la familia (hemi sombreado). b En P2: Deleción heterocigota 15q23.3 involucrando la región de 0,282-Mb, la que incluye los exones 4-21 del gen IGF-1R. Co-segregación de la deleción heterocigota 15-q23.3 y del fenotipo NF1 en la familia (hemi sombreado). c deleción heterocigota de novo de 4492-Mb en el cromosoma 15 [46,XX del(15) (q26.2:qter)(97,970,832,102,463,314) identificada en P3.

FACS de IGF1R de la superficie celular de células primarias vivas.

Se había propuesto un estado de haploinsuficiencia de IGF1R en cada uno de los 3 pacientes secundario a un estado de decaimiento del ARNm, mediada por una mutación “nonsense”, IGF1R c.3348-3366dup [11], y una mutación heterocigota compuesta hipomórfica del IGF1R, pE121K/E234K [6], que resultó en una disminución significativa de la expresión de la proteína total IGF1R con reducción concomitante de la inducción de la señalización de IGF-1.  Para evaluar si la expresión de IGF1R estaba alterada en una forma similar en los pacientes, en este trabajo se empleó un análisis por citometría de flujo, mediante FACS de células vivas derivadas de P1 y P2, para testear la presencia de IGF1R en la superficie celular (Fig. 3). A diferencia de los métodos que evalúan la expresión total del IGF1R, el análisis FACS provee la cuantificación relativa del IGF1R que se ha translocado en forma apropiada a la superficie de las células, y de esta manera refleja la disponibilidad in vivo del IGF1R.

La media geométrica de las intensidades de fluorescencia (MFI) emitidas por los fibroblastos dérmicos vivos marcados con el anti-IGF1R-PE, en los cultivos de P1 y P2, fue comparado con la MFI media de nuestro panel de fibroblastos normales (C1) y deficientes en IGF1R, previamente caracterizados. Fibroblastos poseyendo las mutaciones previamente descriptas IGF1R c.3348_3366dup o IGF1R p.E121k/

E234K tuvieron MFI basales significativamente disminuidas (46 +/- 9% SD y 37 +/-4%, respectivamente) en relación a C1 no tratados (arbitrariamente asignados un MFI de 100%; Fig. 3a). La MFI de fibroblastos que poseen la variante heterocigota IGF1R p.R877 (P1) o IGF1R VNC (P2) estaba disminuida en forma similar a 39 +/-9 % SD y 46 +/- 13%, respectivamente (Fig. 3a), y comparable a la de las células IGF1R probadamente haploinsuficientes e hipomórficas. Cuando los fibroblastos C1 e IGF1R haploinsuficientes (c.3348_3366dup, p.R877ó IGF1R VNC) fueron tratados con IGF-1 (100 ng/ml, 24 h) la MFI emitida fue reducida en forma reproducible (Fig. 3a, b). En contraste, los fibroblastos heterocigotas compuestos IGF1R p.E121K/E234K demostraron una respuesta pobre al IGF-1 (Fig. 3a). En su conjunto, los resultados sugieren que la disponibilidad de IGF1R salvaje en la superficie celular disminuye significativamente luego de la exposición a IGF-1, posiblemente debido a una internalización ligando-receptor, y este fenómeno se observó tanto en el caso de células normales como en el de células con haploinsuficiencia de IGF1R.

Los autores habían demostrado previamente que una deficiencia de IGF1R puede ser detectada por análisis FACS de PBMCs [18], una muestra biológica mucho más fácilmente accesible que fibroblastos dérmicos primarios establecidos a partir de biopsias de piel. Debido a que había acceso a muestras de sangre entera de P2 y de sus padres, se realizó análisis FACS de IGF1R de superficie celular en PBMCs vivos aislados, para determinar si existían variaciones en la expresión de IGF1R, dependiendo del tipo celular. Es de notar que la madre de P2 posee la misma VNC de IGF1R que su hijo, mientras que el padre tiene la constitución salvaje. Como se muestra en las Figuras 3c y 3d la intensidad de la fluorescencia emitida por los PBMCs anti-IGF1R-PE del paciente P2 (52+/-6% SD) y su madre (50+/-7% SD) estaban reducidas marcadamente y en forma semejante cuando se comparan con los PBMC normales o los del padre (87+/-18 % SD). En todas las muestras analizadas la exposición a 50 ng/ml de IGF-1 durante 1 hora fue suficiente para reducir más aún los niveles detectables de IGF1R (Fig. 3d).

Figura 3
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Fig. 3. Expresión y análisis funcional de IGF1R. Análisis FACS de IGF1R de superficie celular, marcado con anticuerpo anti IGF1R alfa humano conjugado a phicoeritrina (PE), células primarias vivas derivadas de los pacientes afectados. a. Media geométrica de la intensidad de fluorescencia (MFI, mean fluorescence intensity, eje y) emitida por fibroblastos primarios marcados, no tratados (barras negras) y tratados con IGF-1 (100 ng/ml, 24 h, barras blancas) se muestra relativa a MFI de fibroblastos normales no-tratados (C1), a los que se asignó arbitrariamente un valor de 100%. Los experimentos se realizaron al menos 3 veces por duplicado cada vez. P1: R877X; P2 15q26.3 deleción (0,282 Mb). b. Fluorescencia representativa emitida (escala logarítmica, intensidad de fluorescencia, eje x) de fibroblastos vivos (cuentas, eje y), no tratados (en negro) y tratados con IGF-1 (en rojo), para C1, P1 y P2. La región con sombreado gris indica fluorescencia de fondo emitida por el control fibroblástico no marcado. c. Detección de IGF1R de la superficie celular de PBMC de P2 (células mononucleares de sangre periférica, en rojo), y padres (madre: azul/verdoso; padre azul) comparado con PBMCs normales (en negro). A la media geométrica MFI detectada en PBMCs normales se le adjudicó un valor arbitrario de 100%. Los experimentos se realizaron al menos 3 veces por duplicado cada vez. P1: R877X; P2 15q26.3 deleción (0,282 Mb). d. El MFI (eje y) de los PBMC marcados en c luego del tratamiento con IGF-1 (50ng/ml, 1 h.) comparando con no-tratamiento (barras negras), realizado 2 veces por duplicado. A los PBMCs no tratados se les dió un valor de 100%. e. Western immunoblot representativo de fibroblastos primarios tratados IGF-1 (100 ng/ml, 20 min).

Señalización de IGF1R inducida por IGF-1

La confirmación de que la haploinsuficiencia en P1 y en P2 correlacionaba con la señalización reducida de IGF1R, los cultivos de fibroblastos dérmicos fueron estimulados con 100 mg/ml de IGF-1durante 20 min y se evaluó la fosforilación de THr308 sobre AKT, fosfo –T308. Los fibroblastos primarios de ambos pacientes demostraron una disminución de la fosforilación AKT T308 comparando con células C1.

Discusión

La importancia de tener dos alelos intactos del gen IGF1R para un crecimiento intrauterino y postnatal normal está apoyado por el reconocimiento de que la haploinsuficiencia de IGF1R es causal de retardo de crecimiento pre y post natal [8]. La haploinsuficiencia de IGF1R puede ser la consecuencia de una pérdida alélica de IGF1R debida a deleciones cromosómicas 15q26 (reportadas por primera vez em 1991 [20]; P2 y P3 en este reporte) o debida a mutaciones alélicas específicas de IGF1R que anulan el ARNm [11] o la expresión de la proteína (P1 en este reporte). En este estudio hemos demostrado que los niveles de IGF1R de la superficie celular estaban reducidos al menos al 50%, cuando células vivas primarias confirmadas genéticamente como haploinsuficientes, se analizaron por FACS, y que esta reducción se correlacionaba con una disminución en la señalización de IGF1R inducida por IGF-1. Esto implica que una expresión bi-alélica de la proteína es crítica para mantener niveles normales de IGF1R en la superficie celular y para una función normal. Estos resultados han servido también para resaltar al análisis por FACS de las células primarias derivadas de pacientes como un método eficiente para evaluar la haploinsuficiencia del IGF1R. Estudios futuros incluirán la verificación de la uniformidad de la expresión de IGF1R en la superficie de las células en subpoblaciones diferentes de PBMCs normales y si la expresión puede ser influenciada por género o edad.

La disponibilidad de IGF1R no fue diferente entre los pacientes con haploinsuficiencia de IGF1R y haber nacido pequeño para edad gestacional y crecimiento postnatal, aún con elevaciones del IGF-1 sérico. Sin embargo, otras características bioquímicas incluido la respuesta a la terapia con rhGH [8, 21] fueron altamente variables [8, 22]. Tanto P1, portando la variante heterocigota nonsense IGF1R p.R877*, y su padre quien porta la misma variante, exhibieron baja estatura moderada (SDS de talla de -2,06y -1,97, respectivamente) pero no tuvieron otras anomalías fenotípicas aparentes. La mutación nonsense p.R877* inhibe la formación de disulfuros mediada por C879 necesaria para la formación de monómeros α β IGF1R, lo que favorece el estado de haploinsuficiencia. Esta mutación es extremadamente rara. Esta variante es probablemente la causa de la moderada baja talla observada en esta familia.

En contraste con P1, P2 y P3 exhibieron una talla baja pronunciada y otras anomalías fenotípicas. Ambos pacientes portaban VNC de IGF1R, aunque P3, que tenía una deleción cromosómica 15q26 (4,5 Mb) significativamente más grande fue el más severamente afectado de los dos, con un fenotipo consistente con el síndrome de deleción 15q26-qter (MIM 612626) incluyendo defectos cardíacos, dismorfismo facial, alteración del procesamiento auditivo, dentición amontonada e hipertelorismo ocular. P2, además de portar una VNC IGF1R también fue diagnosticado con NF-1, pero sus anomalías no fueron las comúnmente asociadas con NF-1 (macrocrania, disminución del empuje puberal de crecimiento en varones, y, en algunos, estado de sobrepeso [23]. Es interesante que no resulta claro porque la madre de P2, que era IGF1R haploinsuficiente, desde el punto de vista genético y funcional, tenía estatura normal. En conjunto, el espectro diverso de las presentaciones de P2 y P3 podría ser la consecuencia de VNC involucrando genes continuos/regiones cromosómicas, además del gen IGF1R [22, 24-26].

La incapacidad de la secuenciación de Sanger dirigida, o del análisis de variaciones en la WES, en detectar deleciones alélicas groseras en el gen IGF1R

ilustra sobre la importancia de incluir el análisis de VNC en la evaluación inicial de niños que se presenten con déficit en el crecimiento prenatal o postnatal y concentraciones elevadas de IGF-1 en suero, sugestivas de insuficiencia de IGF1R. Las deleciones cromosómicas, incluyendo IGF1R, son fácilmente identificables por métodos convencionales, incluyendo el cariotipo (para grandes deleciones), microarray cromosómico, y array genotípico de SNPs, como sucedió con P2, aunque debe ser comentado que la deleción de 0,282 Mb estaba en el límite de la resolución para un análisis por microarray. La aplicación de las sondas “multiplex ligation probe amplification” también ha detectado VNC de IGF1R de pacientes afectados [13, 27]. Sin embargo, el límite de resolución de todos estos métodos requiere metodologías adicionales, para delinear los límites de las VNCs. En el paciente P3, los autores mejoraron los datos de WES existentes utilizándolos como base para el descubrimiento de VNCs, una aplicación que provee una resolución más fina (menos de 1 kb) que los métodos de VNC convencionales. Los datos del WES generados en P3 y sus padres no había identificado candidato alguno significativo para postular variación en nucleótido único, pero a través del análisis XHMM [17], un algoritmo relativamente sensible y específico para detectar VNC extensas y raras [28-30], se descubrieron 27 VNC en P3. De éstas, solamente 1, una deleción heterocigota en el cromosoma 15 de 4492 Mb que se extiende a los largo de 28 genes, entre ellos el IGF1R, era única para P3. Este hallazgo de una deleción incluyendo IGF1R en P3, apoya por lo tanto la eficacia y eficiencia de usar la secuenciación exómica para la detección de ambas, variantes y VNC, y está en línea con la propuesta del paradigma “primero-el-exoma” para la investigación clínica de defectos genéticos [28]. Aunque fue exitoso al aplicarlo en este estudio, probablemente se requiera un algoritmo más refinado al aplicarlo en forma generalizada al “workup” genético de pacientes con enfermedades raras.

Finalmente, las opciones terapéuticas para pacientes con haploinsuficiencia de IGF1R están por ahora limitadas a la rhGH, debido a que la mayoría de estos pacientes nacen SGA sin catch-up de crecimiento, una condición clínica aprobada para la terapia con rhGH. Si bien un tratamiento de largo plazo comenzando a una edad joven ha sido exitoso para mejorar la talla en algunos pacientes [5, 13, 21], incluyendo P1 quien tenía una talla baja moderada, las respuestas generales al tratamiento son altamente variables [8. 21]. Por ejemplo, P3 mejoró su su estatura en solo 1 DS luego de 3 años de terapia con rhGH, alcanzando un SDS de talla de -4,1 a la edad de 9,5 años, y no se reportó catch-up de crecimiento en el paciente con haploinsuficiencia de IGF1R secundaria a la mutación c.3348_3366dup19 [11]. P2 no recibió tratamiento con rhGH por la preocupación de un impacto en su condición de NF-1. La razón(es) de la respuesta tan variable a rhGH no se conoce y hay preocupación por las respuestas excesivas de la concentración de IGF-1 en suero, como se observó en P1 y P3. Se recomienda un monitoreo continuo del IGF-1 en suero y un ajuste de la dosis es altamente recomendable.

En resumen, la base molecular de la haploinsuficiencia de IGF1R puede establecerse por métodos múltiples, incluyendo la utilización de datos genómicos-globales para descubrir VNC de IGF1R, como se demuestra en esta publicación. En este trabajo se enfatiza el hecho de que los datos genómicos-amplios pueden servir para un propósito doble descubrir una variante y una VNC. El análisis FACS de células primarias vivas derivadas de pacientes con haploinsuficiencia de IGF1R apoyó el hallazgo genético y, más aún, proveyó información importante sobre la disponibilidad del IGF1R en la superficie celular, que es crítico para su función de promotor del crecimiento. Se requerirán investigaciones futuras para delinear cuan comparables son los mecanismos que favorecen la disponibilidad del IGF1R en el amplio espectro los fenotipos clínicos y respuestas variables a la terapia con rhGH.

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Publicado en: Edición 65 - Septiembre 2017, Revisión de Temas
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